乳腺癌组织中黑色素瘤相关抗原C2的表达及
本文来源：中华肿瘤杂志,,43(8):-.
DOI：10./cma.j.cn--
本文引用：李楠,侯冉,赵连梅,等.乳腺癌组织中黑色素瘤相关抗原C2的表达及其机制[J].
摘要
目的探讨黑色素瘤相关抗原C2(MAGE-C2)在乳腺正常组织、良性病变组织和癌组织中的表达、表达机制及临床意义。
方法分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化法检测60例乳腺正常组织、60例乳腺良性病变组织和60例乳腺癌组织中MAGE-C2mRNA和蛋白的表达，分析其与乳腺癌患者临床病理特征及预后的关系。以DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)干预人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-后，采用RT-PCR法检测MAGE-C2mRNA表达的变化。
结果乳腺癌组织中MAGE-C2mRNA阳性表达率为61.7%(37/60)，MAGE-C2蛋白阳性表达率为58.3%(35/60)，乳腺正常组织和良性病变组织中未见MAGE-C2mRNA及蛋白的表达。MAGE-C2蛋白表达与乳腺癌的病理类型、组织学分级、脉管瘤栓有关(均P0.05)。MAGE-C2蛋白表达阳性乳腺癌患者的无复发生存率低于MAGE-C2蛋白表达阴性的患者(χ2＝4.，P＝0.)。多因素Cox回归分析显示，临床分期(HR＝4.，P＝0.)、淋巴结转移(HR＝3.，P＝0.)和MAGE-C2蛋白表达(HR＝4.，P＝0.)是乳腺癌患者无复发生存的独立影响因素。对照组和TSA组乳腺癌细胞中未见MAGE-C2mRNA表达，5-aza-CdR组乳腺癌细胞中可见MAGE-C2mRNA表达(MCF-7细胞为0.±0.，MDA-MB-细胞为0.±0.)，联合应用5-aza-CdR和TSA可使乳腺癌细胞中MAGE-C2mRNA表达进一步增加(MCF-7细胞为1.7±0.，MDA-MB-细胞为1.±0.)。
结论MAGE-C2是肿瘤特异性抗原，其表达与乳腺癌患者的不良预后有关，DNA甲基化和组蛋白乙酰化可能是调控MAGE-C2基因表达的重要机制。
肿瘤免疫治疗具有副作用小、特异性高的特点，己成为继手术、放疗、化疗后的第4种治疗模式。黑色素瘤相关抗原(melanoma-associatedantigen,MAGE)是癌/睾丸抗原(cancertestisantigen,CTA)家族成员，在多种肿瘤组织中表达，而在正常组织中仅表达于睾丸生殖细胞，是肿瘤免疫治疗的理想靶点[1]。迄今发现的MAGE家族成员有60多种[2]，鉴定每种MAGE抗原在不同肿瘤中的表达状况是其成为免疫治疗靶点的前提。MAGE在肿瘤中表达的确切机制尚不十分清楚。有研究表明，DNA甲基化和组蛋白乙酰化可能是调控MAGE-A家族表达的重要机制[3,4]。然而，关于MAGE-C家族表达的表遗传学机制研究鲜有报道。在本研究中，我们检测了乳腺正常组织、良性病变组织及癌组织中MAGE-C2的表达情况，分析了其与乳腺癌患者临床病理学特征及预后之间的关系，应用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)干预乳腺癌细胞，初步探索其表达的机制。
一、材料与方法一、材料
1．主要试剂：
L-15培养基、RPMI培养基购自Gibco公司，TRIzol购自美国Invitrogen公司，5-aza-CdR和TSA购自美国Sigma公司，兔抗人MAGE-C2多克隆抗体购自美国Proteintech公司。
2．细胞株：
人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-来自医院科研中心。
3．组织标本：
于医院乳腺外科接受手术治疗患者的乳腺正常组织、良性病变组织(包括腺病和纤维瘤)及癌组织各60例。乳腺正常组织取自距离癌组织5cm以上的正常腺体组织。所有组织标本均经病理检查证实。患者术前均未接受放疗、化疗及内分泌治疗等抗肿瘤治疗。本研究经医院伦理委员会批准(批准文号：)，所有患者均签署书面知情同意书。
二、患者随访
采用门诊复查、电话等方式对60例乳腺癌患者进行随访，记录患者的复发转移和生存状况。随访时间16～60个月，13例患者失访。
三、实验方法
1．细胞培养：
将人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-分别用含8%NaHCO3、10%胎牛血清、μg/ml链霉素、U/ml青霉素的L-15和RPMI培养液，于37℃、5%CO2环境下培养。
2．药物干预细胞：
分别收集MCF-7和MDA-MB-，各设4组：(1)5-aza-CdR组：以5-aza-CdR终浓度为5μmol/L的培养基培养72h；(2)TSA组：以TSA终浓度为0.5μmol/L的培养基培养24h；(3)联合组：以5-aza-CdR终浓度为5μmol/L的培养基培养48h后，再加入TSA终浓度为0.5μmol/L的培养基继续培养24h；(4)对照组：不加任何药物处理。
3．逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测MAGE-C2mRNA的表达：
以TRIzol试剂提取细胞或组织标本的总RNA，逆转录合成cDNA。进行PCR扩增，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)为内参照，无菌双重蒸馏水为空白对照。MAGE-C2：正向引物序列为5′-ATTTTCCCCCTCTTCTTTCTCCACATCC-3′，反向引物序列为5′-AACTCCACTAACTCGGCCACCTTTTCAT-3′，bp；GAPDH：正向引物序列为5′-ACCTGA-CCTGCCGTCTAGAA-3′，反向引物序列为5′-TCCA-CCACCCTGTTGCTGTA-3′，bp。反应条件：95℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳。测定条带的灰度值，作为MAGE-C2mRNA相对表达量。实验重复3次，取其平均值。
4．免疫组织化学染色：
按SP法免疫组化试剂盒说明书步骤操作。将兔抗人MAGE-C2多克隆抗体以1∶50稀释。以成年男性正常睾丸组织为阳性对照，乳腺正常组织为阴性对照。
结果判定方法：细胞质或细胞核含棕黄色颗粒者为阳性细胞。按细胞的染色强度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞百分比评分：阳性细胞百分比≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，75%为4分。将2项评分的乘积作为总评分，总评分3分为阴性，≥3分为阳性。
四、统计学方法
应用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。计数资料的组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。采用一致性检验和Spearman相关分析明确乳腺癌组织中MAGE-C2mRNA和蛋白表达的关联。无复发生存率(recurrence-freesurvival,RFS)的计算采用Kaplan-Meier法，RFS的组间比较采用logrank检验，乳腺癌患者无复发生存影响因素的单因素和多因素分析采用Cox回归模型分析。检验水准α＝0.05。
二、结果1．乳腺癌组织中MAGE-C2mRNA的表达：
RT-PCR检测结果显示，60例乳腺正常组织和60例良性病变组织中均未见MAGE-C2mRNA表达，而60例乳腺癌组织中有37例MAGE-C2mRNA表达阳性(图1)，阳性率为61.7%。
注：MAGE-C2:黑色素瘤相关抗原C2； GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶； 1～6:乳腺癌组织
图1逆转录聚合酶链反应检测乳腺癌组织中MAGE-C2mRNA的表达
2．乳腺癌组织中MAGE-C2蛋白的表达：
免疫组化法检测显示，MAGE-C2蛋白主要定位于细胞质，部分定位于细胞核。60例乳腺正常组织和60例良性病变组织中未见MAGE-C2蛋白的表达(图2、图3)，而60例乳腺癌组织中有35例MAGE-C2蛋白表达阳性(图4)，阳性率为58.3%。MAGE-C2mRNA和蛋白表达具有较好的一致性(κ＝0.)，且呈正相关(r＝0.，P0.)。
图2乳腺正常组织中MAGE-C2蛋白表达阴性 免疫组化 ×
图3乳腺良性病变中MAGE-C2蛋白表达阴性 免疫组化 ×
图4乳腺癌组织中MAGE-C2蛋白的表达 免疫组化 × A:阳性表达； B:阴性表达
3．MAGE-C2蛋白表达与乳腺癌临床病理学特征的关系：
MAGE-C2蛋白表达与乳腺癌的病理类型、组织学分级、脉管瘤栓有关(均P0.05)，而与患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、雌激素受体(estrogenreceptor,ER)表达、孕激素受体(progestrogenreceptor,PR)表达及人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER-2)表达无关(均P0.05，表1)。浸润性导管癌患者MAGE-C2蛋白的表达率高于髓样癌和浸润性小叶癌患者，组织学分级Ⅲ级患者MAGE-C2蛋白的表达率高于Ⅰ级患者，脉管瘤栓阳性的患者MAGE-C2蛋白的表达率高于脉管瘤栓阴性的患者。
4．MAGE-C2蛋白表达与乳腺癌患者预后的关系：
MAGE-C2蛋白表达阳性患者的RFS低于MAGE-C2蛋白表达阴性的患者(χ2＝4.，P＝0.;图5)。
图5黑色素瘤相关抗原C2(MAGE-C2)蛋白表达阳性和阴性乳腺癌患者的无复发生存曲线
以无复发生存时间为因变量，单因素Cox回归分析显示，淋巴结转移、临床分期、MAGE-C2蛋白表达与乳腺癌患者的无复发生存有关(均P0.05，表2)。多因素Cox回归分析显示，临床分期(HR＝4.,P＝0.)、淋巴结转移(HR＝3.，P＝0.)和MAGE-C2蛋白表达(HR＝4.，P＝0.)是乳腺癌患者无复发生存的独立影响因素(表3)。因髓样癌不适合进行组织学分级，故Cox回归分析时未纳入组织学分级这一变量。
5．药物干预前后乳腺癌细胞中MAGE-C2mRNA表达水平的变化：
RT-PCR检测显示，对照组和TSA组乳腺癌细胞中未见MAGE-C2mRNA表达，5-aza-CdR组乳腺癌细胞中可见MAGE-C2mRNA表达，联合应用5-aza-CdR和TSA可使乳腺癌细胞中MAGE-C2mRNA表达进一步增加(图6)。统计分析显示，无论在MCF-7细胞，还是MDA-MB-细胞中，5-aza-CdR组MAGE-C2mRNA表达水平均高于对照组和TSA组(均P0.01)，联合组MAGE-C2mRNA表达水平比5-aza-CdR组进一步增高(P0.01)，而TSA组与对照组MAGE-C2mRNA表达水平差异无统计学意义(P0.05，表4)。
三、讨论MAGE家族具有严格的肿瘤特异性表达模式，并能诱导机体产生特异性免疫应答[5]，成为近年来肿瘤免疫治疗研究的热点。MAGE家族根据其表达特异性和基因结构的不同，分为MAGE-Ⅰ和MAGE-Ⅱ两个亚类[6]。MAGE-Ⅰ多为肿瘤特异性抗原，包括MAGE-A、MAGE-B和MAGE-C[7]。MAGE-C2是新近鉴定出的MAGE-C家族成员，定位于人染色体Xq26-27区域[8]。研究表明，MAGE-C2在多发性骨髓瘤[9]、肺癌[10]、食管癌[11]、肝癌[12]中均有不同频率的表达。
MAGE-C2编码的抗原肽可被MHC-Ⅰ类分子递呈给细胞毒性T淋巴细胞，进而特异性杀伤肿瘤细胞，发挥抗肿瘤作用[13]。本研究结果显示，乳腺正常组织和良性病变组织中均未见MAGE-C2mRNA及蛋白表达，而乳腺癌组织中MAGE-C2mRNA和蛋白阳性表达率为分别为61.7%和58.3%，表明MAGE-C2是肿瘤特异性抗原，有可能成为乳腺癌免疫治疗的靶点。
有研究显示，在非小细胞肺癌患者中，鳞状细胞癌MAGE-A4和A10的表达率明显高于腺癌[14,15]；MAGE-C1的表达与黑色素瘤的病理类型有关[16]。本研究结果显示，不同病理类型乳腺癌MAGE-C2的表达频率不同，浸润性导管癌患者MAGE-C2的表达率高于髓样癌和浸润性小叶癌患者。这些研究结果提示，以MAGE为基础进行的肿瘤免疫治疗也许更适合在某些病理类型的肿瘤中进行。本研究结果还显示，组织学分级Ⅲ级患者的MAGE-C2表达率高于Ⅰ级患者，脉管瘤栓阳性患者的MAGE-C2表达率高于脉管瘤栓阴性的患者。组织学分级越高提示肿瘤的侵袭性越强，患者的预后越差。而脉管瘤栓是影响乳腺癌预后的危险因素，脉管瘤栓阳性往往提示患者预后不良[17]。于是我们推测，MAGE-C2表达可能与乳腺癌的恶性程度及不良预后密切相关。
我们进一步分析了MAGE-C2表达和乳腺癌患者预后的关系，结果显示，MAGE-C2表达阳性患者的RFS明显低于MAGE-C2表达阴性的患者。多因素Cox回归分析显示，MAGE-C2表达、淋巴结转移和临床分期是乳腺癌患者预后的独立影响因素，MAGE-C2表达阳性的乳腺癌患者预后不良。有研究显示，MAGE-C2高表达是三阴性乳腺癌不良预后的独立危险因素[18]，MAGE-A3、MAGE-C2高表达与非小细胞肺癌和食管癌患者的生存率呈负相关[19,20]。
MAGE表达的确切机制尚不十分清楚。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是两种重要的表观遗传学调控机制，在肿瘤中可调控多种基因的表达。因此，在本研究中，我们应用5-aza-CdR和TSA干预乳腺癌细胞株，结果显示，单用5-aza-CdR可诱导MAGE-C2mRNA表达，联合应用5-aza-CdR和TSA可使MAGE-C2mRNA表达量进一步增加，而TSA单独作用对MAGE-C2mRNA表达没有影响。因此我们推测，DNA甲基化和组蛋白乙酰化是调控MAGE-C2表达的重要机制，二者具有协同作用，DNA甲基化在MAGE-C2表达中扮演主导作用，而组蛋白乙酰化是DNA甲基化的继发事件。因为MAGE-C2在乳腺癌中呈不均质表达，这一特点限制了以MAGE-C2为基础的肿瘤免疫治疗的应用范围。应用5-aza-CdR和TSA诱导或增强MAGE-C2在肿瘤组织中的表达，有望解决这一难题。
综上所述，MAGE-C2是肿瘤特异性抗原，其表达与乳腺癌患者的预后密切相关。5-aza-CdR和TSA可协同诱导MAGE-C2的表达。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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